免疫印迹技术编辑

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免疫印迹法是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测, 具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点，是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法，如组织抗原的定性定量检测、多肽分子的质量测定及病毒的抗体或抗原检测等。

不适宜人群：无　检查时禁忌：无　检查时禁忌：(1) 一抗、二抗的稀释度、作用时间和温度对不同的蛋白要经过预实验确定最佳条件。　(2) 显色液必须新鲜配置使用，最后加入H2O2。　(3) DAB有致癌的潜在可能，操作时要小心仔细。

检查过程

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(1) 蛋白质样品获得：细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。　(2) 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。　(3) 转移：(半干式转移)　① 电泳结束后将胶条割至合适大小，用转膜缓冲液平衡，5min×3次。　② 膜处理：预先裁好与胶条同样大小的滤纸和NC膜，浸入转膜缓冲液中10min。　③ 转膜：转膜装置从下至上依次按阳极碳板、24层滤纸、NC膜、凝胶、24层滤纸、阴极碳板的顺序放好，滤纸、凝胶、NC膜精确对齐，每一步去除气泡，上压500g重物，将碳板上多余的液体吸干。接通电源,恒流1mA/cm2，转移1.5hr。转移结束后，断开电源将膜取出,割取待测膜条做免疫印迹。将有蛋白标准的条带染色，放入膜染色液中50s后，在50%甲醇中多次脱色，至背景清晰，然后用双蒸水洗，风干夹于两层滤纸中保存，留与显色结果作对比。　(4) 免疫反应：　① 用0.01M PBS洗膜，5min ×3次。　② 加入包被液，平稳摇动，室温2hr。　③ 弃包被液，用0.01M PBS洗膜，5min×3次。　④ 加入一抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释，液体必须覆盖膜的全部)，4℃ 放置12hr以上。阴性对照，以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。　⑤ 弃一抗和1%BSA，用0.01M PBS分别洗膜，5min×4次。　⑥ 加入辣根过氧化物酶偶联的二抗(按合适稀释比例用0.01M PBS稀释)，平稳摇动，室温2hr。　⑦ 弃二抗，用0.01M PBS洗膜，5min×4次。　8、加入显色液，避光显色至出现条带时放入双蒸水中终止反应。