中文名：副密码子

外文名：Deputycodon

性质：氨基酸分子的区域

所属领域：生物学

tRNA 分子上决定其携带氨基酸分子的区域称为副密码子。

mRNA的核苷酸顺序与蛋白质的氨基酸顺序之间在结构上并没有直接的相应关系,二者也不发生直接的相互作用。在这两种不同的遗传语言之间,必须通过译员才能互相沟通。扮演这种译员角色的就是各种tRNA分子。如果没有tRNA的存在,也就无所谓密码子了。因此密码子的意义并不是单独由mRNA决定的,而是由mRNA和携带氨基酸的tRNA相互作用所决定的。然而, tRNA分子上的反密码子与其相应的氨基酸之间并无结构上的相关性,而且tRNA分子本身并不能催化相应氨基酸的荷载,而是需要相应的氨酰基-tRNA合成酶来催化。那么,氨酰基-tRNA合成酶又是如何识别它的两个底物的呢?　对于氨基酸来说,该酶无疑是识别它们的侧链基团; 而对于tRNA分子来说,氨酰基-tRNA合成酶又是识别哪个基团呢? 原来,每个tRNA分子上有一个特异的小区以供其氨酰基-tRNA合成酶所识别,这就是tRNA分子上的副密码子。荷载相应氨基酸的tRNA分子并不能独立地与mRNA发生作用,因为单靠密码子与反密码子三个碱基对之间的氢键联结是无法保证配对精确性的,更无法形成肽键并促成肽链的起始,延伸和终止。这就需要核糖体和有关因子的存在。在遗传信息流动的各个过程中,参与翻译过程的生物大分子数目最多。因此,翻译过程是一个极为复杂的过程。

（1）一种氨酰tRNA 合成酶可以识别一组同功tRNA （多达6个），它们的副密码子有共同的特征。

（2）副密码子没有固定的位置，亦可能不止1个碱基对。

（3）尽管副密码子不能单独与氨基酸发生作用，但副密码子可能与氨基酸的侧链基团有某种相应性。

（4）并非所有的tRNA氨基酸柄上的G3·U70都是它的副密码子。

用改变碱基的方法研究其他tRNA的副密码子，结果不但在氨基酸柄和反密码子环上、而且在D环和TyC环上也找到“副密码子”；而且对应于同一AARS来说，有好几处“副密码子”。所以把“副密码子”的那些碱基，改称为AARS的认同要素(identity element)。

用化学法将E. coli的tRNAfMet约一半碱基改变，表明氨基酸柄、D柄环和TyC柄环的碱基改变，都可导致fMetRS使此tRNAfMet氨酰化的能力降低；而反密码子环上C34、A35的改变，则完全不能被fMetRS氨酰化；说明tRNAfMet的反密码子对fMetRS的识别起主要作用。

采用片段移植法将某种tRNA的某一片段移植到另一种tRNA上，然后测定其应接的氨酰基，结果表明在20种同功tRNA中，有17种的识别要素(recognition element)是在反密码子上。

将各种tRNA的反密码子改造成为抑制琥珀型无义突变(amber suppressor)的反密码子(5’CUA3’)，又将二氢叶酸还原酶（DHFR）基因的10位密码子改造成为UAG，然后进行蛋白质合成实验，测定DHFR的10位氨基酸残基。其结果与片段移值法的结果基本一致，即反密码子对AARS的识别起重要作用。

将tRNAfMet的反密码子改造成为其他各种tRNA的反密码子，进行翻译实验，测定第1位氨基酸残基，结果仍然证明反密码子对AARS的识别起重要作用。

同一种AARS识别要素往往是有几处，但各处碱基的作用有主次之分。例如氨基酸柄、73位和反密码子，对于MetRS、AspRS、GlyRS的识别都起作用，但以反密码子为主。

tRNA除了为相应的AARS提供认同的正控要素外，还要为其他AARS提供排斥的反控要素；tRNAAsnGUU的认同要素只是反密码子上的单一核苷酸；如果将tRNAAsnGUU的反密码子GUU改造成为tRNALys的反密码子UUU，则不是被AsnRS认同，而是被LysRS认同，结果生成Lys-tRNAAsnGUU。

tRNA分子上出现多处AARS识别要素的原因在于AARS的不同。AARS按其亚基结构可以分为a1、a2、a4和（ab）4等多种。多肽链长短相差很大，从嗜热脂肪芽抱杆菌（Bacillus stearothermophilis）TrpRS的329aa，到E. coli ValRS的951aa。MW从59kDA~380kDa。

关于AARS识别tRNA上识别要素的机制问题，因AARS高分辨率空间结构分析的数据很少而不明确。GlnRS的Asp235对识别至关重要。

NOrmonly等人试验

上世纪70年代初，发现tRNATyr琥珀抑制在氨基酸接受柄上的突变能使tRNATyr错误地携带Glu。1984年，Prather等发现突变的tRNALys不仅保留对Lys的特异性，而且也能携带Ala或Gly。这个突变的错义抑制tRNALys是在氨基酸接受柄螺旋区的G3·C70被G3·U70碱基对所取代。

Normanly等的实验显示，取代tRNALeu中的12个碱基(无反密码子碱基的取代)，能够使tRNALeu转变为丝氨酸的tRNA。琥珀型抑制性tRNACys、tRNAPhe和tRNAAla，其反密码子均是CUA，而它们却携带不同的氨基酸。实验证明tRNA氨基酸接受臂上的G3·U70是tRNAAla独有的。对tRNAAla的36个非保守碱基作28种定点突变(包括反密码子改变)，只要保持G3·U70不变，仍能接受Ala；tRNAAla和tRNACys的G3·U70突变体，都能接受Ala甚至把tRNAAla的A9至C48或A14至U55缺失，只剩留有G3·U70的微型tRNAAla，仍能接受Ala；若把G3·U70改变，则不再接受A1a。将G3·U70引入tRNACys或tRNAPhe，亦可予二者携带Ala的功能。

tRNA氨基酸柄的3’CCA末端携带相应的氨基酸的作用是通过氨酰tRNA合成酶（AARS）完成的。AARS在密码翻译过程中十分重要。tRNA识别氨基酸的能力，是由AARS赋予的。反密码子在决定tRNA的特异性并非是唯一的关键。如tRNAAla的氨基酸柄上的G3·U70似乎是tRNAAla的副密码子，参与同AARS的作用。

侯雅明和Schimmel试验

1988年Hou Ya-ming（候雅明）和Schimmel首先取得了这方面的突破。他们采用的方法是：选用发生色氨酸琥珀突变(UGG→UAG)的营养缺陷型E.coli (trp)来进行研究；这种突变型必须在加有色氨酸的培养基上才能生长。当用含有校正tRNA，它携带着Ala，但反密码子突变成CUA，因此可以和终止密码子UAG相配对，这样校正了色氨酸的琥珀突变，在色氨酸突变位点加入了Ala 。转化E.coli后只要校正率达到3%，该trp菌株就可在普通培养基上生长。然后他们用点突变的方法来改变校正tRNA（Ala）上的各个位点，观察对识别Ala有何影响，以此来确定与识别特异氨基酸的有关位点。他们获得了28个突变株。分别转化E.coli (trp)，再检测转化后的E.coli (trp)在基本培养基上是否能生长。若仍能生长，说明相应的点突变位点和氨基酸的识别无关，若不能生长说明相应的点突变位点与tRNA的“身份”有关。

他们用上述方法证明了Ala tRNA的G3:U70碱基对，仅一对碱基决定了丙氨酰tRNA合成酶与tRNA的识别，他们就把这样很小的元件称之为tRNA的“identity”，或称为副密码子（paracodon）。已知的tRNA的“身份”如表14-5所示。

Schimmel , Hou ya-ming和施建平等用合成的微螺旋做氨基酸接受试验，证明只要具有Ala tRNA受体臂那样长的微螺旋，或者具有该tRNA受体臂和TψC茎连在一起的小螺旋，且在受体臂有相当于G3-U70的碱基对，它们就能接受Ala，已发现带有了三种不同反密码子（CUA, GGC, UGC）的Ala tRNA都具有G3-U70副密码子。

表14-5表明这些位置的共同特点是：

（1）关键位点的数很少（1~5）个；

（2）副密码子较集中在反密码子和受体臂上，此与tRNA的L型三维结构和氨基酰-tRNA聚合酶结合的空间构型有关；

（3）由于一个碱基对不能足以使20套tRNA被普遍的识别，因此不同的tRNA都有自己特殊的规律来进行识别。

氨基酸-tRNA是由氨基酸-tRNA合成酶催化产生的。这种酶需要三种底物即氨基酸,tRNA和ATP。ATP提供了活化氨基酸所需要的能量。氨基酸首先活化成氨基酸腺苷酸(这一中间产物与酶相结合),然后再与tRNA生成氨基酸-tRNA：

aa +ATP ←→aa-ADP + ppi

aa-ADP +　tRNA ←→aa-tRNA + ADP

总反应：　aa + tRNA + ADP ←→aa-tRNA + ADP + ppi

细胞内有20种氨基酸,有40种以上的tRNA,氨基酸tRNA合成酶是如何选择正确的氨基酸和tRNA的呢? 人们至今尚未弄清其详细作用机制。按照一般原理,酶和底物的正确结合是由二者相嵌的几何形状所决定的。只有适合的氨基酸和适合的tRNA进入合成酶的相应位点,才能合成正确的氨酰基-tRNA。已经知道合成酶与L形tRNA的内侧面结合,结合点包括接受臂,DHU臂和反密码子臂。在这几个位点上的tRNA突变则妨碍正确的氨基酸接载。

乍看起来,反密码子似乎应该与氨基酸的正确荷载有关,对于某些tRNA也确实如此。然而对于大多数tRNA来说,情况并非如此。人们早就知道,来源于少数tRNA的抑制tRNA,尽管它们的反密码子已经改变(识别无义密码子),但它们携带氨基酸的性质并没有改变。1986年,Normanly等人将亮氨酸tRNA分子中置换了12个核苷酸(反密码子未动),则变成了携带丝氨酸的tRNA。1988年,侯雅明和Schimmel做了十分出色的试验:将丙氨酸抑制tRNA(tRNAAla/CUA)分子突变了许多位点,组成了28种突变体(14种在接受臂上)。结果发现,许多突变体都不改变接载丙氨酸的性质,而只有改变G3:U70这一碱基对的突变体才表现出明显的突变效应(不能抑制trpA基因中第234个amber无义突变)。另外两种amber抑制tRNA(tRNACys/CUA,tRNAPhe/CUA)虽然对于trpA基因中的无义突变能够抑制,但都不能恢复TrpA+表现型,因为半脱氨酸或苯丙氨酸的插人都不能形成有活性的α亚基。尽管这两个抑制tRNA分别有38个和31个核苷酸不同于tRNAAla/CUA,但是如果将它们的C3:U70改变为G3:U70,均能为丙氨酸tRNA合成酶所识别。这就说明,G3:U70是丙氨酸tRNA分子决定其本质(携带丙氨酸)的主要因素。

由上所述,可以看出,一种氨基酸tRNA合成酶可以识别一组同功tRNA(最多达6个),这说明它们具有共同特征。例如丙氨酸tRNA合成酶识别G3:U70,在已发现的三种丙氨酸tRNA(tRNAAla/CUA,tRNAAla/GGC,tRNAAla/UGC)都具有G3:U70副密码子。但还没有充足的证据说明其他氨酰基tRNA合成酶在其同功tRNA组中也是识别相同的副密码子。其次,副密码子并没有固定的位置,亦可能并不止一个碱基对。例如上述的tRNACys/CUA和tRNAPhe/CUA都具有C3:G70,显然它们的副密码子不在C3:G70或者不完全在C3:G70,因为它们携带两种不同的氨基酸。第三,尽管副密子不是单独与氨基酸发生作用,但是副密码子可能与氨基酸的侧链基团有某种相应性。tRNA分子对错误接载的氨基酸具有校对功能,可能就是来源于这种相应性。副密码子可能是从立体化学上决定相应氨基酸的"原始副密码子"(protoparacodon)进化而来。人们早就推测,tRNA分子起源于能够携带氨基酸的寡聚核苷酸。这种识别氨基酸的特异性在某种程度上保留下来,而反密码子是在tRNA分子进化过程中后来才出现的。这就是说,副密码子比密码子和反密码子更为古老。

关于氨基酸-tRNA合成酶和tRNA参与校对的分子细节还不清楚。该系统可以通过多级的校对功能排除错误的接载。其中主要有动力学校对(Kinetic proofreading),构象校对(conformational proofreading)和化学校对(chemical proofreading)。动力学校对是基于合成酶对于错误氨基酸形状的识别,即使生成氨基酸腺苷酸形式,也会将它水解。构象校对是在氨酰基腺苷酸生成以后,由于tRNA的进入引起酶构象的改变,使得已生成的氨酰基腺苷酸不符合进一步连接成氨基酸-tRNA的要求,从而水解之。化学校对是指错误的氨基酸已接载到tRNA上之后,被合成酶的tRNA结合位点所发现,然后水解之。虽然说不少人倾向于最后一步机制,但都缺少令人信服的证据。

破译副密码子的意义不仅仅限于tRNA分子本身生物学功能的认识，更重要的是将对生物化学，生物起源，分子生物学及遗传学产生重大影响。

tRNA的结构

tRNA

1.tRNA结构保守：70-80个碱基。

2.二级结构：三叶草。

3.五个主要臂：(1)接受臂：携带氨基酸；(2)TΨC臂；(3)反密码子臂；(4)双氢尿嘧啶臂（DHU）；

(5)附加臂：大小反映了整个tRNA分子的大小，根据其大小，tRNA分为两类：第Ⅰ类tRNA，3/4 tRNA只有3-5个碱基的附加臂；第Ⅱ类tRNA，其余含有13-21碱基的附加臂。

4.三级结构：倒L形

(1)所有的tRNA分子均具有L形状，采取A构象；

(2)接受臂上存在G·U配对；

(3)三维结构靠氢键堆积力；

(4)所有的tRNA具有同样得空间结构。

(5)接受臂、反密码子臂位于双螺旋的两端；

(6)TΨC臂位于L的两臂交间处；

(7)维持空间结构的力是氢键和碱基堆积力。

密码子与反密码子

1.密码子：DNA或mRNA的四种碱基共组成64个三联体密码子。

2.终止密码子：又称无义密码子，指3个肽链终止密码，不编码氨基酸。

3.携带稀有氨基酸的tRNA也能识别终止密码子。

4.简并密码：由多种密码子编码一个氨基酸的现象。

5.摇摆性：(1)定义：指一种反密码子能够与不同的密码子发生碱基配对；

(2)决定因素：摇摆性取决于反密码子噗噜空间结构。tRNA空间结构中，相邻碱基存在着堆集力，反密码子5′端的一个碱基处在堆集碱基的末端，所受堆集力小，自由度较大，而且常为修饰过的碱基，无A和U，A修饰为I（次黄），与U、C、A配对。

6.同功tRNA：携带AA相同而反密码子不同的一组tRNA，一组同功tRNA由同一种氨酰基-tRNA合成酶催化而携带氨基酸。

7.有时拥有相同反密码子的tRNA有好几种，它们的结构有很大的差异，有不同的基因编码。

tRNA对氨基酸的识别

tRNA通过反密码子和mRNA上的密码子相互配对，将特定的氨基酸运送到核糖体上肽链合成位点上，但是tRNA如何来识别特定的氨基酸呢？这就涉及tRNA的“身份”（identity）问题，这个问题是核酸领域的热点之一。人们需要解决几个问题：（1）tRNA怎样接受特定的氨基酸，氨基酰－tRNA合成酶怎样识别tRNA；（2）tRNA中的哪些结构和接受特定氨基酸有关。