红细胞凝集试验编辑

红细胞凝集的现象

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红细胞凝集指红细胞凝集的现象。有由病毒、细胞凝集素和抗体而引起的红细胞凝集。

（1）由病毒而引起的凝集：G．H．Hirst（1941）发现流感病毒能使鸡的红细胞发生凝集，其后又发现其它各种病毒也能引起同样的红细胞凝集反应。即红细胞表面存在着对各种病毒的受体，病毒与受体结合，以红细胞为桥梁的结果而引起凝集。利用此反应可以进行病毒的定性和定量。另外，如果存在抗病毒的抗体时，则由病毒引起的凝集作用将被抑制，所以可用于抗病毒抗体的检出。

（2）由抗体引起的凝集：

（a）如果存在对红细胞表面决定基的抗体，则红细胞亦将凝集。可用于测定对抗红细胞的抗体的效价或鉴定人的血型。

（b）在红细胞表面，如果人为地使之吸附或结合特定的抗原物质，则与该抗原相对应的抗体将引起红细胞凝集（被动凝集反应或间接凝集反应，psssive he-magglntination）。

试验方法

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血凝及血凝抑制试验

有些病毒具有凝集某种(些)动物红细胞的能力，称为病毒的血凝，利用这种特性设计的试验称血球凝集(HA)试验，以此来推测被检材料中有无病毒存在，是非特异性的，但病毒的凝集红细胞的能力可被相应的特异性抗体所抑制，即血球凝集抑制(HI)试验，具有特异性。通过HA-HI试验，可用已知血清来鉴定未知病毒，也可用已知病毒来检查被检血清中的相应抗体和滴定抗体的含量。

目的要求

掌握病毒HA和HI试验的原理和基本操作方法，了解其实用价值。

材料与试剂

1. 96孔“U”形或“V”形微量反应板，50 uL定量移液器，滴头，微型振荡器。

2. 生理盐水，0.5%鸡红细胞悬液，新城疫病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），新城疫阳性血清，被检鸡血清。

实验内容及操作方法

（一）血球凝集(HA)试验

1. 在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 uL生理盐水。

2. 于左侧第1孔加50 uL病毒液（尿囊液或冻干疫苗液），混合均匀后，吸50 uL至第2孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃50 uL；第12孔为红细胞对照。

3. 自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液50 uL，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果（表4-1）。

表4-1 病毒血凝试验的操作方法（单位：uL）

孔号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
病毒稀释度	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024	1:2048	对照
生理盐水	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
病毒液	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
0.5%红细胞	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
弃50
结果观察	++++	++++	++++	++++	++++	++++		+++	+	+	-	-

4. 结果判定：从静置后10 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100% 凝集（++++），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。

以100% 凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。

(二) 血球凝集抑制(HI)试验

1. 根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。

2. 在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，自第1孔至第11孔各加50 uL生理盐水。

3. 第1孔加被检鸡血清50 uL，吹吸混合均匀，吸50 uL至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50 uL，稀释度分别为：1:2、1:4、1:8 …… ；第12孔加新城疫阳性血清50 uL，作为血清对照。

4. 自第1孔至12孔各加50 uL 4个血凝单位的新城疫病毒液，其中第11孔为4单位新城疫病毒液对照，振荡混合均匀，置室温中作用10min 。

5. 自第l孔至12孔各加0.5% 鸡红细胞悬液50 uL，振荡混合均匀，室温下静置后观察结果（表4-2）。

表4-2 病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：mL）

孔号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10	11	12
血清稀释度	1:2	1:4	1:8	1:16	1:32	1:64	1:128	1:256	1:512	1:1024	病毒对照	血清对照
生理盐水	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
被检鸡血清	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50		50
4单位病毒	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
室温中静置 10 min
0.5%红细胞	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50	50
弃去50
结果观察	-	-	-	-	-	-	+	++	+++	++++	++++	-

6. 结果判定：待病毒对照孔（第11孔）出现红细胞100%凝集（++++），而血清对照孔（第12孔）为完全不凝集（-）时，即可进行结果观察。

以100%抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。

从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。

制备方法

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1. 阿氏液（Alsever）：即红细胞保养液

枸橼酸钠（5H2O） 0.80g

枸橼酸（H2O） 0.055g

葡萄糖 2.05g

氯化钠 0.42g

双蒸水加至 100 ml

将以上试剂加热溶解于双蒸水中，调整pH至6.8，115℃灭菌10min,4℃保存备用。

2. 0.5% 鸡红细胞制备方法

先用灭菌注射器吸取3.8% 枸橼酸钠溶液(其量为所需血量的1/5)，从鸡翅静脉或心脏采血至需要血量，置灭菌离心管内，加灭菌生理盐水为抗凝血的2倍，以2000r/min离心10min，弃上清液，再加生理盐水悬浮血球，同上法离心沉淀，如此将红细胞洗涤三次，最后根据所需用量，用灭菌生理盐水配成0.5%鸡红细胞悬液。

3. 96孔微量反应板的清洗

将浸泡有75%乙醇的棉签放入微量反应板的每个孔内旋转，用自来水冲洗反应板5次，再用蒸馏水冲洗3次以上，置37℃温箱中干燥。

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