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腺苷脱氨酶(也称为腺苷氨基水解酶,或ada)是参与嘌呤代谢的酶(EC3.5.4.4)。它需要从食物中分解腺苷和组织中核酸的转换。它在人体中的主要功能是免疫系统的发育和维持。然而,ADA的完整生理作用尚未完全了解。
ADA以小形式(作为单体)和大形式(作为二聚体 - 复合物)存在。在单体形式中,酶是多肽链,折叠成8股平行的α/β桶,其围绕作为活性位点的中央深口袋。除8个中心β-桶和8个外周α-螺旋外,ADA还含有5个额外的螺旋:残基19-76倍折成三个螺旋,位于β1和α1折叠之间;两个反平行的羧基末端螺旋位于β-桶的氨基末端。
ADA活性位点含有锌离子,锌离子位于活性位点的最深凹陷处,由来自His15,His17,His214,Asp295和底物的五个原子配位。锌是活动所必需的唯 一辅助因子。
底物腺苷被稳定并通过9个氢键与活性位点结合。与基质嘌呤环大致共面的Glu217的羧基在适当位置与基质的N1形成氢键。Asp296的羧基也与底物嘌呤环共面,与底物的N7形成氢键。Gly184的NH基团处于与底物的N3形成氢键的位置。Asp296与Zn形成键离子以及底物的6-OH。His238也与底物6-OH形成氢键。底物核糖的3'-OH与Asp19形成氢键,而5'-OH与His17形成氢键。在活性位点的开口处,通过基质的2'-OH和3'-OH,在水分子上形成另外两个氢键。
由于酶内活性位点的凹陷,基质一旦结合,几乎完全与溶剂隔离。当结合时,基材对溶剂的表面暴露是自由状态下基材的表面暴露的0.5%。
所提出的ADA催化脱氨作用机理是通过四面体中间体进行立体特异性加成 - 消除。通过任何一种机制,作为强亲电试剂的Zn激活水分子,水分子被碱性Asp295去质子化以形成攻击性氢氧化物。His238定向水分子并稳定攻击氢氧化物的电荷。将Glu217质子化以将质子提供给底物的N1。
由于锌,Asp295和His238残基的位置,反应是立体特异性的,其全部面向底物的嘌呤环的B侧。
ADA被认为是嘌呤代谢的关键酶之一。该酶已在细菌,植物,无脊椎动物,脊椎动物和哺乳动物中发现,具有高度的氨基酸序列保守性。高度的氨基酸序列保守性表明ADA在嘌呤补救途径中的关键性质。
首先,人类的ADA参与免疫系统的发育和维持。然而,还观察到ADA关联与上皮细胞分化,神经传递和妊娠维持有关。还提出,除腺苷分解外,ADA还刺激兴奋性氨基酸的释放,并且是A1腺苷受体和异源三聚体G蛋白偶联所必需的。腺苷脱氨酶缺乏会导致肺纤维化,表明长期暴露于高水平的腺苷可以加剧炎症反应而不是抑制它们。还已经认识到腺苷脱氨酶蛋白和活性在过表达HIF-1α的小鼠心脏中上调,这部分地解释了在缺血应激期间表达HIF-1α的心脏中腺苷的减弱水平。
腺苷脱氨酶基因中的一些突变导致它不被表达。由此产生的缺陷是严重联合免疫缺陷(SCID)的一个原因,特别是常染色体隐性遗传。ADA水平不足也与肺部炎症,胸腺细胞死亡和T细胞受体信号缺陷有关。
有证据表明不同的等位基因(ADA2)可能导致自闭症。
ADA水平升高也与艾滋病有关。
有两种ADA同种型:ADA1和ADA2。
ADA1存在于大多数体细胞中,特别是淋巴细胞和巨噬细胞中,它不仅存在于胞质溶胶和细胞核中,而且还存在于与二肽基肽酶-4(aka,CD26)连接的细胞膜上的外胚层中。ADA1主要参与细胞内活动,并且以小形式(单体)和大形式(二聚体)存在。小型到大型的相互转换受肺中“转换因子”的调节。
ADA2首次在人类脾脏中发现。随后在包括巨噬细胞在内的其他组织中发现它与ADA1共存。这两种同种型调节腺苷与脱氧腺苷的比例,增强了寄生虫的杀灭。ADA2主要存在于人血浆和血清中,并且仅作为同型二聚体存在。
ADA2是人血浆中存在的主要形式,并且在许多疾病中增加,特别是与免疫系统相关的疾病:例如类风湿性关节炎,牛皮癣和结节病。在大多数癌症中血浆ADA2同种型也增加。ADA2不是普遍存在,而是仅在单核细胞 - 巨噬细胞中与ADA1共存。
可以使用高效液相色谱法或酶法或比色法测量总血浆ADA。也许最简单的系统是测量腺苷在分解为肌苷时释放的氨。在用腺苷的缓冲溶液温育血浆后,氨与BERThelot试剂反应形成蓝色,其与酶活性的量成比例。为了测量ADA2,在孵育之前加入赤 - 9-(2-羟基-3-壬基)腺嘌呤(EHNA)以抑制ADA1的酶活性。缺乏ADA1引起SCID。
ADA也可用于淋巴细胞性胸腔积液或腹膜腹水的检查,因为这种低ADA水平的样本基本上不考虑结核病。
结核性胸腔积液现在可以通过增加胸膜液腺苷脱氨酶水平,每升40 U以上来准确诊断。
近十几年来,随着对ADA的深入研究,检测方法也不断发展。目 前已发展了四代。
第一代ADA测试
ADA将腺苷 (Adenosine) 脱氨产生次黄苷(Inosine) 和氨 (NH3)。一个ADA活性单位在测试特定条件下每分钟脱氨1μmole腺苷成为次黄苷。通过动态测量腺苷265nm处吸光度下降的速度,可以测算ADA的活性大小。Kaplan法 (1955) 由此建立。由于高底物浓度造成吸光度过高,该法仅适用于腺苷浓度低于40μM。如此低的底物浓度达不到底物饱和要求,造成ADA活性检测失真。因此,该法不适用于临床应用。
第二代ADA测试
原理为腺苷脱氨酶催化腺嘌呤核苷水解,产生次黄嘌呤核苷和氨。然后用Berthelot显色反应(1859)测定反应过程中产生氨的量,从而计算血清ADA活性单位。所需试剂易配制,仪器简单,但灵敏度低,易受外源性NH3影响,空白过高,不能直接测定红细胞ADA活性。
同样原因,ADA偶联谷氨酸脱氢酶(Glutamate Dehydrogenase, GLDH)反应:
通过测量340nm处NADPH吸光度下降的速度来测算ADA活性。该法也因血清含氨干扰,以及测试系统中过高NADPH造成非特异性氧化而无成算。
第三代ADA测试
Kalckar氏应用ADA偶联嘌呤核苷磷酸化酶(Purine nucleoside phosphorylase,PNP) 和黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase, XOD) 反应连续监测法。通过测量293nm处尿酸盐吸光度上升的速度来测算ADA活性。
但是,293nm时血清吸光度太高,造成临床应用不便。
第四代ADA测试
通过ADA偶联PNP,XOD,过氧化氢酶(Catalase)和醛脱氢酶(Aldehyde dehydrogenase),借助过氧化氢(H2O2)反应测量334nm处NADPH吸光度上升的速率来测算ADA活性。该法克服了以往ADA测试的困难,然而,鉴于试剂成本高,阻碍实际临床使用。
最新对第四代测试方法的改进为偶联PNP,XOD和过氧化物酶(Peroxidase, POD)反应。ADA酶解腺苷(Adenosine)脱氨产生次黄苷(Inosine);再通过PNP的作用,生成次黄嘌呤(Hypoxanthine);后者在XOD氧化下生成尿酸(Uric Acid)和过氧化氢(H2O2);最后在POD的作用下H2O2再与N-Ethyl-N-(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-3-methylaniline (EHSPT)、4-氨基安替比林(4-aminoantipyrine, 4-AA)反应(Trinder氏反应),生成紫红色的有色醌(Quinone dye)。通过动态测量有色醌550nm处吸光度上升的速度来测算ADA的活性。从反应原理可知NH4+对该法无影响。其原理反应方程式如下:
反应具有测定精密度高,抗干扰能力强,适合自动化快速测定的特点,为临床常规开展ADA检测应用创造了有利条件。
迈克腺苷脱氨酶(ADA)检测试剂盒性能指标
检测方法:XOD-PAP法(第四代改良法),不与其它核苷反应,无NH4+影响,灵敏度高。
剂 型:液体双试剂,直接使用,避免复溶引起瓶间差。
线性范围:0~200U/L,γ2≥0.99
准 确 度:不准确度正常水平≤15%,异常水平≤10%。
稳 定 性:密闭避光贮存2~8℃可稳定12个月,开瓶上机2~8℃避光稳定30天。
抗干扰能力:标本中胆红素≤342umol/L,血红蛋白≤200mg/dl,甘油三酯≤8.47mmol/L,抗坏血酸≤4mg/dl 及NH4+对本试剂测定无影响。
适 用 性:适用于各种半/全自动生化分析仪。