双缩脲试剂 编辑

分析化学试剂
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双缩脲试剂是一种用于鉴定蛋白质分析化学试剂。它是一种碱性的含试液,呈蓝色,由0.1g/mL氢氧化钾、0.01g/mL酸铜和酒石酸钾钠配制而成。双缩脲试剂本是用来检测双缩脲,由于蛋白分子中含有很与双缩脲结构相似的肽键,因此也能与铜离子在碱性溶液发生双缩脲反应。当底物中含有键时,试液中的铜与多肽配位,络合物呈紫色。可通过比色法分析浓度,在紫外可见光谱中的波长为540nm。鉴定反应的灵敏度为5-160mg/mL。双缩脲试剂中真正起作用的是硫酸铜,而氢氧化钾仅仅是为了提供碱性环境,因此它可被其他碱,如氢氧化钠所代替。向试剂中加入化钾,会延长试剂的使用寿命。酒石酸钾钠的作用是保护反应生成的络离子不被析出变为沉淀,从而使试剂失效。

基本信息

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中文名:双缩脲试剂

外文名:BiuretReagent

应用:检测含肽键的物质,包括双缩脲,蛋白质

相关反应:双缩脲反应

制作:0.1g/mL氢氧化钠或氢氧化钾、0.01g/mL硫酸铜和酒石酸钾钠配制而成

配制

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双缩脲试剂A是质量分数为0.1g/mL的NaOH溶液;

双缩脲试剂B是质分数为0.01g/mL的CuSO4水溶液.

先在待测液中加入双缩脲试剂A 3mL,振荡均匀(营造碱性环境),再加入1~2滴双缩脲试剂B,振荡均匀。如果待测液里含有蛋白质,那么会看到溶液变成紫色。具有两个或两个以上肽键的化合物皆可与双缩脲试剂产生紫色反应。

蛋白质的肽键在碱性溶液中能与Cu2+络合成紫色的络合物。颜色深浅与蛋白质浓度成正比。

注意事项

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在使用双缩脲试剂时候,必须注意,必须是先加0.1g/mL氢氧化钠溶液,再加0.01g/mL硫酸铜的水溶液。若先加入硫酸铜溶液,再加入氢氧化钠溶液,则无法充分制造碱性环境,此时CuSO4会与NaOH发生复分解反应,生成蓝色氢氧化铜沉淀,导致现象不清,无法较好地达到实验目的 。

与双缩脲区别

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双缩脲(NH2CONHCONH2)是两个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物

双缩脲试剂是由双缩脲试剂A和双缩脲试剂B两种试剂组成。

双缩脲试剂A的成分是氢氧化钠的质量分数为0.1g/mL的水溶液;

双缩脲试剂B的成分是硫酸铜的质量分数为0.01g/mL的水溶液。

双缩脲试剂可以验证蛋白质的存在,遇蛋白质产生紫色。

简单的说,双缩脲是一种化学物质,而检测蛋白质用的那两个试剂之所以叫双缩脲试剂,是因为检测原理和双缩脲的形成相似。

方法学评价

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优点:双缩脲法测定蛋白质的测定范围是1~10mG蛋白质,操作简单、快捷。既适合手工操作,又适合自动化分析,重复性好、线性关系好, 双缩脲试剂可以长期保存( 若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制)。

缺点:灵敏度差,测定范围窄,样品需要量大,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,因此它常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。干扰测定的物质包括有:在性质上是氨基酸或肽的缓冲液,如TrIs缓冲液,因为它们产生阳性呈色反应,铜离子也容易被还原,有时出现红色沉淀 。

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