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放射免疫分析法 编辑
1960年美国化学家R.S.耶洛和S.A.贝尔森提出此法,耶洛因此于1977年获得诺贝尔生理学或医学奖。
她从小酷爱自然科学。在大学里,她热衷于物理学,却致力於医学研究,她工作於纽约市布隆克斯区退伍军人医院,致力于「胜太荷尔蒙的放射免疫分析」。居里夫人自传和核子物理学家美籍意大利人费米的讲演,对她后来的事业产生了很大的影响。她渴望从事科学研究工作。然而,当时的美国,哪个大学也不同意将一笔物理学奖金给一个女人。她主动给一位杰出的化学家当非全日制秘书。由于工作出色,几个月后,伊利诺依大学给了她一份奖学金,并给了她一个助理研究员的位置。从1941年到1945年,她把主要精力都用在三项活动上:教学、钻研高深课题和准备核物理博士论文。她于1945年获得博士学位。从1945年起,她边授课,边研究,边著书立说,并在勃隆克斯医院筹备和开发新的放射性同位素应用工作。
早在得奖的二十多年前,耶洛便在一个偶然的机会里,发现猪胰脏的胰岛素可用来治疗糖尿病,可以使病人产生抗体。这种发现与当时的治疗理论不太合适。因为治疗药物能引起抗体是不可思议的事,因此其发现并不为当时的人所接受。然而,这个发现却引导近代内分泌学的研究进入了新的境界,更由此而推展,使得已往不易测定的身体中的物质得以测定。这个方法就是放射免疫测定法,又叫放射免疫测定法(radioimmunoassav,简称RIA)。80年代初,应用此法测定的生物活性物质已达300种以上。
使放射性标记抗原和未标记抗原(待测物)与不足量的特异性抗体竞争性地结合,反应后分离并测量放射性而求得未标记抗原的量。用反应式表示为:
分别在一定数量的试管中加入不同浓度的标准抗原(或未知样品),每管加入等量的放射性标记抗原和一定量的抗体,在4℃或37℃下保温,待反应平衡后,选用适当的方法将B和F分离,测量放射性强度,由放射性强度比B/T对Ag量制出标准曲线,即可从标准曲线上查出未知样品量。测定时,首先要制备出纯的抗原和抗体。凡能刺激机体产生抗体,且与抗体发生特异性结合反应的物质通称为抗原,例如蛋白质(细菌、病毒、异种血清等)。只有反应原性而无免疫原性的物质称为不完全抗原或半抗原,如多糖、类脂和一些小分子物质。可用化学方法把一些半抗原与载体(蛋白质的大分子)结合而获得免疫原性,这种结合为RIA 开辟了广泛的应用范围。常用的载体有γ球蛋白、纤维蛋白质、鸡卵蛋白、血蓝蛋白和各种甲状腺球蛋白。半抗原结合载体是由半抗原的功能基团与载体功能基团所决定,一般连接后不应引起半抗原结构改变,也不使载体蛋白变性。常用结合载体的方法有混合酸碱法、水溶性的羰二亚胺法等。
抗体是能与相应抗原或半抗原专一地结合的免疫球蛋白分子。应用免疫技术可以获得特异性的抗体。抗体的敏感度范围由其特异性和亲和力决定,测定时所用的抗体稀释度越低,则加入的量越多,测定的敏感度越低,可测范围越宽。如加入抗体量少,则测定的敏感度提高,可测范围变窄。一般在选定标记抗原用量后,即可根据测定要求来选择合适的抗血清用量。
常用于标记抗原的放射性同位素有3H、125I、131I 等,3H可以置换有机化合物中的氢,且不影响原有化学性质。3H半衰期长,能量低,便于防护,常用的标记化合物有3H环磷酸鸟苷、3H环磷酸腺苷、3H睾丸酮等。125I 和131I原子的化学性质比较活泼,标记方法简便,不论多肽、蛋白质或小分子半抗原均可进行碘标记。有些半抗原不能直接用碘标记, 常常接上一个酪氨酸再以碘标记,以减少标记抗原免疫化学活性的损失。常用的偶联试剂有:碳化二亚胺类、异?唑盐类、烷基氯甲酸酯类、二异氰酸盐类及亚氨酸酯等。
RIA法的优点是灵敏、特异、简便易行、用样量少等,常可测至皮摩尔。本法虽然也用放射性物质,但一般都是在测试样品时再加入标记的同位素示踪物,此示踪物的放射性强度极低,一般不会对实验者引起辐射损伤。本法的缺点是有时会出现交叉反应、假阳性反应,组织样品处理不够迅速,不能灭活降解酶和盐及pH有时会影响结果等。
在本法的基础上,近年来又发展了其他免疫分析法,用其他有特殊性质的物质代替放射性同位素来标记抗原,同样利用标记与未标记抗原与抗体的竞争性结合,然后用适宜方法测定。其中研究较多的是荧光免疫分析,采用荧光化合物标记抗原,结合分离后通过荧光值的测定进行定量分析。