northern印迹杂交编辑

将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法

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northern印迹杂交（NOrthern blot）。这是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。DNA印迹技术由Southern于1975年创建，称为Southern印迹技术，RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交，与此原理相似的蛋白质印迹技术则被称为Western blot。

Northern印迹杂交的RNA吸印与Southern印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在上样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2'-羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5μg/ml EB的0.1mol/L醋酸铵中10min，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光，若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。

琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但是有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

原理：

整合到植物染色体上的外源基因如果能正常表达，则转化植株细胞内有其转录产物——特异mRNA的生成。将提取的植物总RNA或mRNA用变性凝胶电泳分离，则不同的RNA分子将按分子质量大小依次排布在凝胶上；将他们原位转移到固定膜上；在适宜的离子强度及温度条件下，用探针与膜杂交；然后通过探针的标记性质检测出杂交体。若经杂交，样品无杂交带出现，表明外源基因已经整合到植物细胞染色体上，但在该取材部位及生理状态下该基因并未有效表达。

RNA甲醛凝胶电泳和吸印方法

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试剂

10×MSE缓冲液：0.2mol/L吗啉代丙烷磺酸（MOPS），pH7.0，50mmol/L醋酸钠，1mmol/LEDTApH8.0。

5×载样缓冲液：50%甘油，1mmol/LEDTA，0.4%溴酚蓝。

甲醛：用水配成37%浓度（12.3mol/L），应在通风柜中操作，pH高于4.0。

20×SSC；

去离子甲酰胺；

50mmol/LNaOH(含10 mmol/L NaCl)；

0.1mol/LTris，pH7.5。

步骤

40ml水中加7g琼脂糖，煮沸溶解，冷却到60℃，加7 ml 10×MSE缓冲液，11.5ml甲醛，加水定容至70ml，混匀后倒入盛胶槽。

等胶凝固后，去掉梳子和胶布，将盛胶槽放入1×MSE缓冲液的电泳槽。

使RNA变性（最多20μg），RNA4.5ml，10×MSE缓冲液20ml，甲醛3.5ml，去离子甲酰胺10ml。

55℃加热15min，冰浴冷却。

加2 ml 5×载样缓冲液。

上样、同时加RNA标记物（同位素（³²P）dCTP）。

60伏电泳过夜。

取出凝胶，水中浸泡2次，每次5min。

室温下将胶浸到50mmol/LNaOH和10mmol/LNaCl中45min，水解高分子RNA，以增强转印。

室温下将胶浸到0.1mmol/L TriShcl(pH7.5)中45min，使胶中和。

20×SSC洗胶1h。

20×SSC中过夜转印到硝酸纤维素膜上。

取出硝酸纤维素膜，80℃真空烘烤2h。

注意事项

严格遵守试验规则，务必准确。

由于好多药品是有毒的，对人体有害，请注意自身安全，做好防护。

常见问题

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Northern杂交常见问题及解析
①Northern杂交后继过程的试剂能不能不用DEPC处理？不处理会不会影响结果？做Northern blot时，一般要求是所有的试剂都必须用DEPC处理，这是操作流程的要求，以抑制RNA酶的活性。DEPC是一种致癌剂，须小心操作，尤其在用DEPC处理乙酸铵时，因为DEPC能与铵离子反应产生氨基甲酸乙酯（一种潜在的致癌剂）。也有人认为杂交液、预杂交液、洗膜液实际上可以不用DEPC处理，但杂交液（无探针）、预杂交液、洗膜液必须要在15磅的条件下高压30min，这样做Northern blot也可以做出来，否则就有可能失败。
②DEPC处理试剂会不会对所配置的溶液的pH值造成影响？ DEPC是极弱酸性的，由于其处理水的浓度仅有万分之一，故用DEPC处理试剂不会导致其pH值明显变化。
③以Northern杂交鉴定RNA在组织中的表达量，判断依据是否就是最后膜条带显影的亮度? 一般可以认为Northern杂交是mRNA绝对定量的方法，但必须参考内参的信号，才能估算不同组织中的表达量。
④背景很高背景很高的原因有多种： ·标记探针时，未掺入的dNTPs没有完全从探针中除去。建议使用PCR产物纯化柱来纯化探针。 ·DNA探针的平均大小过大。最佳大小范围为200~800核苷酸。 ·杂交溶液中探针浓度过高。对于DNA探针来说，浓度不要超过10ng/ml；对于寡聚核苷酸探针来说，不要超过50ng/ml。 ·封闭不彻底。 ·不管是在何种条件下洗涤，如果延长洗膜时间仍不能改善背景状况的话，则要洗脱膜上的探针重新进行杂交。
⑤没有杂交信号或杂交信号很弱可能有以下原因： ·RNA降解。解决方案参见①。 ·上样量不足。一定要保证足够的上样量，尤其是在检测低丰度RNA时，总RNA通常需要50μg，溶于上样缓冲液中。 ·电泳条件不合适。比如胶浓度太小、电泳时加样孔偏长或电泳时间偏长，均易使较小的RNA片断弥散，电泳0.5~1h为宜。 ·如果X线胶片曝光30~60min后仍没有杂交信号产生，可能是杂交探针的活性很低，需重新标记探针。必要时，可采用Sephades G-50柱层析法纯化标记的探针，以去除标记反应中未结合的（游离的）核苷酸。 ·如果重新标记后探针的比活性仍然很低，则可能是标记时DNA的用量太少。DNA的用量通常为25~50ng（可根据浓的母液的OD₂₆₀值计算）。如果手头上DNA的样品量很少，可将标记时使用的DNA量点样在琼脂糖凝胶上，旁边点上已知含量的DNA标准样品一起电泳，从中估算出探针DNA的量。经溴化乙锭染色后，如果看不到明显的探针DNA带，说明DNA量少于20~50ng，那么在标记时要加大2~3倍的DNA量如果仍然失败，则要用已知含量的对照探针（如β-actin探针）来优化标记条件。 ·还有一种可能是探针与靶基因不完全同源。如果是用种间交叉的探针进行杂交，则应降低最后洗涤条件的严格程度，将洗涤温度提高到50~56℃，并用洗涤液1代替洗涤液3。如果是用合成的寡聚核苷酸探针进行杂交，则应确保探针与靶基因完全同源。
⑥无法去除探针和再次杂交杂交膜如果不能再次杂交，很可能是上次杂交的探针没有完全从膜上去除，也可能是因膜已经干燥或部分干燥造成的。如果膜已经干燥哪怕只是部分干燥，要想除去膜上的探针已是不可能的了。因此，在整个洗膜过程中应避免使膜干燥。在完成洗涤后，用镊子将膜夹起滴去多余的洗涤液（不要使膜干燥），立即用塑料薄膜将膜包裹住。
⑦杂交2次后信号减弱这种现象在低丰度基因中极为常见，即使是高丰度基因（如β-actin），经过2轮杂交后，杂交信号也不可能像通常看到的那样强。
⑧杂交膜能否重复使用？结合了待测RNA的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其他探针杂交。方法如下：杂交的膜（注意：杂交过的膜在保存过程中不能干燥，否则探针将会与膜形成不可逆的结合）置100℃ 0.5% SDS中煮沸3min，自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2~3遍。取出膜，用滤纸吸去膜表面的水分。将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。尼龙膜可反复使用5次以上。
⑨其他如使用同位素标记探针，操作时必须仔细、小心，严格按同位素操作规程进行，以防止同位素污染。