中文名：等点聚焦电泳

外文名：IsoelECTricfocusing

精度：可以分辨等电点只差0.001pH单位

优势：分辨力高，重复性好，样品容量大

1. 将胶条切成小块，用水浸泡后，用精密pH试纸或进口的细长pH复合电极测定pH值，然后作图。

2. 用表面pH微电极直接测定胶条各部分的pH值，然后作图。

3. 用一套已知不同的pI值的蛋白质作为标准，测定pH梯度的标准曲线。

4. 将胶条于－70℃冰冻后切成1mm的薄片，加入0.5ml 0.01M KCl，用微电极测其pH。

1. 电泳仪

2. 垂直管式园盘电泳槽一套

3. 注射器与针头

4. 移液管：10ml、5ml、2ml、1ml、0.1ml

5. 小烧杯若干

6. 培养皿一套

7. 直尺

8. 小刀

9. 精密pH试纸和带细长复合pH电极的pH计

10. 塑料薄膜和橡皮筋

1. 丙烯酰胺

2. 甲叉双丙烯酰胺

3. 两性电解质Ampholine（40%，pH3.5~9.5）

4. 过硫酸胺（催化剂）

5. TEMED（四甲基乙二胺）（加速剂）

6. 磷酸

7. NaOH

8. 三氯乙酸（TCA）

1. 丙烯酰胺贮液（30%丙烯酰胺，交联度2.6%）：，30g丙烯酰胺和0.8g甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，滤去不溶物后存于棕色瓶，4℃可保存数月。（全班公用）（另一配方为29.1g 丙烯酰胺和0.9g 甲叉双丙烯酰胺溶于H2O，定容至100ml，交联度为3.0%）。

2. 两性电解质Amphline（40%）的加入量为：50ml /ml 胶液。

3. 过硫酸胺：配成1mg/ml的浓度，当天配制，配100ml全班公用。胶液中的加入量为0.5mg/ml胶液。

4. TEMED：胶液中的加入量为1ml/ml胶液。

5. 蛋白质样品：选用两种等电点相差较大的蛋白质，每根垂直管中每种蛋白质的加样量控制在<100mg。蛋白质样品配制成各为5mg/ml的浓度。配2.5ml全班公用。

6. 固定液：10%的三氯乙酸，每组配50ml。

7. 阳极电极液：0.1M H3PO4

3.4ml 浓磷酸（85%）加H2O至500ml，每个电泳槽用500ml。

8. 阴极电极液：0.5M NaOH

2g NaOH 加H2O溶解至500ml，每个电泳槽用500ml。

1. 配胶

过硫酸铵是胶聚合的催化剂，因此最后加入，加毕，立即摇匀，因胶很快就会聚合，必须立即装管。通常化学聚合的胶液，需在过硫酸铵加入前进行减压抽气处理，本实验将此抽气步骤省略并不影响实验结果。

2. 装管

每个学生装两支管，每组装四支。先用肥皂洗手，然后将圆盘电泳槽的玻璃管洗净，底端用塑料薄膜和橡皮筋封口，垂直放在试管架上，用移液管将配好的胶液移入管内，（每根玻璃管的容量约为1.5~1.8ml）,液面加至距管口1mm处，用注射器轻轻加入少许H2O，进行水封，以消除弯月面使胶柱顶端平坦。胶管垂直聚合约30分钟，聚合完成时可观察到水封下的折光面。

3. 装槽和电泳

用滤纸条吸去胶管上端的水封，除去下端的薄膜，水封端向上，将胶管垂直插入圆盘电泳槽内，调节好各管的高度，记下管号。每支管约1/3在上槽，2/3在下槽。上槽加入500ml 0.1M H3PO4，下槽加入500ml 0.1M NaOH，淹没各管口和电极，用注射器或滴管吸去管口的气泡。上槽接正极，下槽接负极，开启电泳仪，恒压160V，聚焦2至3小时，至电流近于零不再降低时，停止电泳。

4. 剥胶

取下胶管，用H2O 将胶管和两端洗2次，用注射器沿管壁轻轻插入针头，在转动胶管和内插针头的同时分别向胶管两端注入H2O少许，胶条即自行滑出，若不滑出可用洗耳球轻轻挤出。胶条置于小培养皿内，记住正极端为“头”，负极端为“尾”，若分不清时，可用pH试纸鉴定，酸性端为正，碱性端为负。

5. 固定

取2支胶条置于一个小培养皿内，倒入10%三氯乙酸溶液至没过胶条，进行固定，约半小时后，即可看到胶条内蛋白质的白色沉淀带。固定完毕，倒出固定液，用直尺量出胶条长度“L2”和正极端到蛋白质白色沉淀带中心（即聚焦部位）的长度“L’”。

固定后的胶条可在康强860紫外/可见分光光度计上用280nm或238nm波长作凝胶扫描，然后用扫描图作相应的测量和计算。

6. 测定pH梯度

将放在另一个培养皿内未固定的胶条，用直尺量出待测pH胶条的长度“L1”。按照由正极至负极的顺序，用镊子和小刀依次将胶条切成10mm长的小段，分别置于小试管中，加入1ml H2O，浸泡半小时以上或过夜，用仔细校正后的带细长pH复合电极的pH计测出每管浸出液的pH值。