中文名：比色法

外文名：colorimetry

常用方法：显色反应

基本反应：有色化合物有恒定的组分

以生成有色化合物的显色反应为基础，比色分析对显色反应的基本要求是：反应应具有较高的灵敏度和选择性，反应生成的有色化合物的组成恒定且较稳定，它和显色剂的颜色差别较大。选择适当的显色反应和控制好适宜的反应条件，是比色分析的关键。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，两种方法都是以朗伯-比尔定律(A=εbc)为基础。常用的目视比色法是标准系列法，即用不同量的待测物标准溶液在完全相同的一组比色管中，先按分析步骤显色，配成颜色逐渐递变的标准色阶。试样溶液也在完全相同条件下显色，和标准色阶作比较，目视找出色泽最相近的那一份标准，由其中所含标准溶液的量，计算确定试样中待测组分的含量。

与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片来消除干扰，从而提高了选择性。但光电比色计采用钨灯光源和滤光片，只适用于可见光谱区和只能 得到一定波长范围的复合光 ， 而不是单色光束，还有其他一些局限，使它无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外-可见分光光度计。20 世纪30～60年代，是比色法发展的旺盛时期，此后就逐渐为分光光度法所代替。

常用的比色法有两种：目视比色法和光电比色法，前者用眼睛观察，后者用光电比色计测量，两种方法都是以朗伯－比尔定律（见紫外-可见分光光度法）为基础。

目视比色法

常用的目视比色法是标准系列法，该法采用一组由质料完全相同的玻璃制成的直径相等、体积相同的比色管，按顺序加入不同量的待测组分标准溶液，再分别加入等量的显色剂及其他辅助试剂，然后稀释至一定体积，使之成为颜色逐渐递变的标准色阶。再取一定量的待测组分溶液于一支比色管中，用同样方法显色，再稀释至相同体积，将此样品显色溶液与标准色阶的各比色管进行比较，找出颜色深度最接近于样品显色溶液的那支标准比色管，如果样品溶液的颜色介于两支相邻标准比色管颜色之间，则样品溶液浓度应为两标准比色管溶液浓度的平均值。标准系列法的主要优点是设备简单和操作简便，但眼睛观察存在主观误差，准确度较低。

光电比色法

光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度，将吸光度对浓度作图，绘制工作曲线，然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。光电比色计通常由光源（钨灯）、滤光片、吸收池、接收器(光电池或光电管)、检流计五部分组成（见图）。光路结构上有单光电池式和双光电池式两种：单光电池式仪器的测量结果受光源强度变化影响较大，而双光电池式仪器则避免了这种影响。

与目视比色法相比，光电比色法消除了主观误差，提高了测量准确度，而且可以通过选择滤光片和参比溶液来消除干扰，从而提高了选择性。光电比色计和紫外－可见分光光度计的光路结构非常相似，它们之间所不同的地方在于：①分光光度计采用棱镜或光栅作色散元件，因而可以得到纯度较高的单色光束。而光电比色计采用滤光片，只能得到一定波长范围的光谱带(复合光)；②紫外－可见分光光度计采用紫外和可见区的光源，即氢灯和钨灯，而光电比色计只用一种钨灯光源，因而前者适用于紫外－可见光谱区，而后者只适用于可见光谱区；③紫外－可见分光光度计可以测定待测组分的精细吸收光谱，不仅可用于定量分析，而且可以作有机化合物的定性和结构分析，而光电比色计只能作定量分析。此外，分光光度计一般都采用灵敏度高的光电倍增管作检测器，而光电比色计一般用光电池或光电管作检测器。因此，光电比色计无论在测量的准确度、灵敏度和应用范围上都不如紫外－可见分光光度计。

在20世纪30～60年代，是比色分析发展的繁盛时期，它广泛用于冶金、地质、金属材料中微量的金属和部分非金属元素的测定。随着光学仪器制造技术的发展，紫外－可见分光光度计应用日益普及，精密度较高而价格又较低的紫外－可见分光光度计已逐渐代替光电比色计，分光光度法也随之逐渐代替了比色法。

最早应用目视比色法，由于用肉眼观察颜色的深浅误差较大，以后改用光电比色计进行测定，光电比色法是利用光电池或光电管测量透过有色溶液后的光亮度，测定时需要放置滤光片，误差较大。多采用具有分光系统(单色器)及检测器的分光光度计，使测定结果准确、省时，选择性好。

在比色分析中，当入射光亮度一定时，液层厚度保持不变，则测得的吸光度A与溶液的浓度c成直线关系。在实际应用时，首先选择被测物质溶液的最大吸收波长(λ_max)，在最大吸收波长时进行比色，灵敏度，然后配制一系列不同浓度的标准溶液，在一定条件下进行显色，分别测定它们的吸光度，将测得的吸光度与浓度的关系作图，得到一条直线，称为标准曲线。测定未知试样时，应在与绘制标准曲线相同的条件下进行显色，测定其吸光度，从标准曲线上查得试样的浓度。

比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的，一般包括两个步骤：首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应，形成有色化合物，然后再比较或测量有色化合物的颜色深度。比色分析对显色反应的基本要求是：

反应应具有较高的选择性，即选用的显色剂只与待测组分反应，而不与其他干扰组分反应或其他组分的干扰很小；

反应生成的有色化合物有恒定的组分和较高的稳定性；

反应生成的有色化合物有足够的灵敏度，摩尔吸光系数一般应在104以上；

反应生成的有色化合物与显色剂之间的颜色差别较大，它们的最大吸收浓度之差一般应在60纳米以上。选用的显色剂可以是一种试剂，也可以是两种不同的试剂。如果待测组分与两种不同的试剂反应生成一种有色化合物，则称为三元络合物显色反应。这类显色反应常常具有更高的灵敏度和选择性，在比色法和紫外-可见分光光度法中应用非常普遍。选择适当的显色反应，研究最合适的反应条件和消除干扰的方法是比色分析的关键问题。溶液的酸度、显色剂的用量、温度、溶剂等对显色反应都有影响。

农药的比色测定有三种类型： ①农药有效成分本身带有颜色，可以直接进行比色。如敌磺钠原药为黄棕色，在波长435纳米处有最大吸收峰，但这种类型的农药较少; ②经化学反应可以生成有色化合物。如对硫磷，经碱解后形成对硝基酚而呈黄色，可在420～480纳米波长范围内测量吸光度。③引入显色基团生成有色化合物。如农药经醇、碱水解产生酚类或芳胺，可与偶氮试剂进行偶合形成有色化合物。例如氨基甲酸酯的甲萘威等，经碱解后生成α-萘酚与对硝基苯偶氮硼氟酸甲醇溶液反应，形成黄色可以在590纳米处测定吸光度。

测定柿叶中总黄酮的含量

利用黄酮类化合物可与金属离子形成有色螯合物的原理，建立柿叶中总黄酮含量测定方法，并且对供试品制备方法进行选择。通过正交试验设计选取供试品制备条件，采用分光光度法，KAc-AlCl3体系与供试品中黄酮提取物反应，选择最大吸收波长，以芦丁为对照品制作标准曲线，并做方法学考察。供试品制备:提取液70%乙醇溶液，提取时间75 min，供试品与乙醇溶液的固液比为1∶50(g/mL)，用KAc-AlCl3体系比色法测定供试品柿叶中总黄酮含量为1.13%，重复性RSD=1.86%(n=6)，平均回收率为99.23%，RSD=0.27%(n=5)。KAc-AlCl3体系比色法测定柿叶中总黄酮含量的方法可行，呈色稳定，操作简便，可作为柿叶中总黄酮的含量测定方法，并可以做为快速测定方法应用于生产中对总黄酮含量的监控。

测土壤脲酶活性

土壤脲酶活性的测定有多种方法，其中靛酚蓝比色法由于测量结果精确性较高，重现性较好，应用最为广泛。但也有培养后土壤过滤液浑浊、带色、脲酶活性受底物浓度影响较大等缺点。以此方法为基础，针对过滤方式、培养时间、底物浓度及缓冲液选择等4个重要参数进行了对比试验，以期进一步改进靛酚蓝比色法的测定准确性。结果表明，培养时选择5%的底物浓度、pH10.0的硼酸盐缓冲液、培养24h后再经KCl溶液浸提过滤比色测定，其结果比传统靛酚蓝比色法高约2.46倍，改良靛酚蓝比色法的测定结果更接近土壤真实脲酶活性。