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限制性核酸内切酶 编辑
别名:restriction endonuclease简称限制酶
酶反应:限制性内切酶能分裂DNA分子在一限定数目的专一部位上。它能识别外源DNA并将其降解。
单位定义:在指明pH与37℃,在0.05mL反应混合物中,1小时消化1μg的λDNA的酶量为1单位。
性状制品不含非专一的核酸水解酶(由10单位内切酶与1μg λDNA,保温16小时所得的凝胶电泳图谱的稳定性表示),这类酶主要是从原核生物中分离出来的,迄今已经从近300多种不同的微生物中分离出约4000种限制酶。
限制性核酸内切酶分布极广,几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性内切酶,多者在一属中就有几十种,例如在嗜血杆菌属中(Haemophilus)现已发现的就有22种。有的菌株含酶量极低,很难分离定性;然而在有的菌株中,酶含量极高.如E. coli的pMB4(EcoRI酶)和H. aegyptius(Hal Ⅲ酶)就是高产酶菌株。据报道从10g的H. aegyptius的细胞中,能分离提纯出可消化10gλ噬菌体DNA的酶量。细菌是限制性内切酶,尤其是特异性非常强的I类限制性内切酶的主要来源。
根据酶的功能特性、大小及反应时所需的辅助因子,限制性内切酶可分为两大类,即I类酶和Ⅱ酶。最早从大肠杆菌中发现的EcoK、EcoB就属于I类酶。其分子量较大;反应过程中除需Mg2+外,还需要S-腺苷-L甲硫氨酸、ATP;在DNA分子上没有特异性的酶解片断,这是I、Ⅱ类酶之间最明显的差异。因此,I类酶作为DNA的分析工具价值不大。Ⅱ类酶有EcoR I、BamH I、Hind Ⅱ、Hind Ⅲ等。其分子量小于105道尔顿;反应只需Mg2+;最重要的是在所识别的特定碱基顺序上有特异性的切点,因而DNA分子经过Ⅱ类酶作用后,可产生特异性的酶解片断,这些片断可用凝胶电泳法进行分离、鉴别。
限制性内切酶识别DNA序列中的回文序列。有些酶的切割位点在回文的一侧(如EcoR I、BamH I、Hind等),因而可形成黏性末端,另一些Ⅱ类酶如Alu I、BsuR I、Bal I、Hal Ⅲ、HPa I、Sma I等,切割位点在回文序列中间,形成平整末端。Alu I的切割位点如下:
5'-A G^C T-3'
3'-T C^G A-5'
在已发现的限制性内切酶中,近百种酶的识别顺序已被测定。有很多来源不同的酶有相同的碱基识别顺序,这种酶称为“异源同功酶”(isochizomer,同切限制内切酶;同裂酶)。应该注意的是,这些酶虽然有相同的识别顺序,但它们的切点并不完全一样。例如Xma I和Sma I都识别六核苷酸CCCGGG,但Xma I的切点在CCCCGGG,而Ema I的切点则在CCCGGGG,前者切割DNA分子,形成带有CCGG粘性末端的DNA片段,而后者并不形成粘性末端(而叫平末端)。当然,也有识别顺序和切点都相同的酶,如Hap Ⅱ、Hpa Ⅱ、MNO I,都在识别顺序CCGG内有一相同的切点,Hal Ⅲ和BsuR I同样在识别顺序GGCC内有一相同的切点。
用于DNA基因组物理图谱的组建;基因的定位和基因分离;DNA分子碱基序列分析;比较相关的DNA分子和遗传工程;进行基因工程编辑。
限制性核酸内切酶是由细菌产生的,其生理意义是提高自身的防御能力.
限制酶一般不切割自身的DNA分子,只切割外源DNA。
第一型限制酶
同时具有修饰(modification)及识别切割(restriction)的作用;另有识别(recognize)DNA上特定碱基序列的能力,通常其切割位(cleavage site)距离识别位(recognition site)可达数千个碱基之远。例如:EcoB、EcoK。
第二型限制酶
只具有识别切割的作用,修饰作用由其他酶进行。所识别的位置多为短的回文序列(palindrome sequence);所剪切的碱基序列通常即为所识别的序列。是遗传工程上,实用性较高的限制酶种类。例如:EcoRI、HindⅢ。
第三型限制酶
与第一型限制酶类似,同时具有修饰及识别切割的作用。可识别短的不对称序列,切割位与识别序列约距24-26个碱基对。例如:HinfⅢ。
限制作用实际就是限制酶降解外源DNA ,维护宿主遗传稳定的保护机制。甲基化是常见的修饰作用,可使腺嘌呤A和胞嘧啶C甲基化而受到保护。通过甲基化作用达到识别自身遗传物质和外来遗传物质的目的。所以,能产生防御病毒侵染的限制酶的细菌,其自身的基因组中可能有该酶识别的序列,只是该识别序列或酶切位点被甲基化了。但并不是说一旦甲基化了,所有限制酶都不能切割。大多数限制酶对DNA甲基化敏感,因此当限制酶目标序列与甲基化位点重叠时,对酶切的影响有3种可能,即不影响、部分影响、完全阻止。对甲基化DNA的切割能力是限制酶内在和不可预测的特性,因此,为有效的切割DNA,必须同时考虑DNA甲基化和限制酶对该类型甲基化的敏感性。另外,大部分商业限制酶如今专门用于切割甲基化DNA。
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