细胞融合编辑

细胞遗传学名词

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细胞融合(CELL fusion)，细胞遗传学名词，是在自发或人工诱导下，两个细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合形成异核体(heterokaryon)、异核体通过细胞有丝分裂进行核融合、最终形成单核的杂种细胞。细胞融合可作为一种实验方法被广泛适用于单克隆抗体的制备，膜蛋白的研究。

有性繁殖时发生的精卵结合是正常的细胞融合，即由两个配子融合形成一个新的二倍体。而细胞融合为在自然条件下或用人工方法（生物的、物理的、化学的）使两个或两个以上的细胞合并形成一个细胞的过程。其中人工诱导的细胞融合，在六十年代作为一门新兴技术而发展起来。由于它不仅能产生同种细胞融合，也能产生种间细胞的融合，因此细胞融合技术目前被广泛应用于细胞生物学和医学研究的各个领域。基因型相同的细胞融合成的杂交细胞称为同核体（homokaryon）；来自不同基因型的杂交细胞则称为异核体（heterokaryon）。

发展简史

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19世纪30年代，科学家们相继在肺结核，天花，水痘，麻疹等疾病患者的病理组织中观察到多核细胞。

细胞融合

19世纪70年代，科学家们在蛙的血细胞中也看到了多核细胞的现象，但是当时科学发展水平的限制，没有给予足够重视。

1962年，日本科学家发现日本血凝型病毒能引起艾氏腹水瘤细胞融合的现象。

1965年，英国科学家进一步证实了灭活的病毒在适当的条件下也可以诱发动物细胞融合。

后来科学家又成功诱导了不同种动物的体细胞融合，并且能将杂种细胞培养成活。细胞融合技术不断改进，现在已广泛应用于细胞学，遗传学，免疫学，病毒学等多种学科的研究工作中。

融合过程

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细胞膜有内外两层，细胞融合首先发生在外层，然后再到内层，由此就出现了两种融合通道，细胞体内物质通过这两种通道转移。病毒膜与目标细胞融合时，只出现一种融合通道，即导致融合的基因只能在病毒中找到，而在目标细胞中却找不到。但是，通过EFF-1发生的细胞融合则是一个双向融合过程，需要EFF-1出现在两个相互融合的细胞中。

研究进展

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Muller于1838年观察到脊椎动物肿瘤细胞能在体内自发地融合产生多核的肿瘤细胞。

Virchow于1858年描述了正常组织、发炎组织以及肿瘤组织中的多核细胞现象。

Luginbuhl于1873年观察到天花病人的血液中也有多核的血细胞存在。

LAnge于1875年第一个观察到脊椎动物（蛙类）的血液细胞发生融合的过程。

Cienkawski(1876）、Buck(1877）、Geddes(1880）在无脊椎动物中发现了细胞合并现象。

1958年日本学者冈田（OkaDA）发现仙台病毒具有触发动物细胞融合的效应。

1974年华裔加拿大学者高国楠创立了聚乙二醇（PEG）化学融合法。

1975年Kohler和Milstein成功地融合了小鼠B-淋巴细胞和骨髓瘤细胞而产生能分泌稳定单克隆抗体的杂交瘤细胞。

20世纪80年代出现了电融合技术。

意义

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⒈理论上说任何细胞，都有可能通过体细胞杂交而成为新的生物资源。这对于种质资源的开发和利用具有深远的意义。

⒉融合过程不存在有性杂交过程中的种性隔离机制的限制，为远缘物种间的遗传物质交换提供了有效途径。

⒊体细胞杂交产生的杂种细胞含有来自双亲的核外遗传系统，在杂种的分裂和增殖过程中双亲的叶绿体、线粒体DNA亦可发生重组，从而产生新的核外遗传系统。

⒋淋巴细胞杂交瘤和单克隆抗体的制备。

融合方法

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同种细胞在培养时2个靠在一起的细胞自发合并，称自发融合；异种间的细胞必须经诱导剂处理才能融合，称诱发融合。

仙台病毒法融合

①两种细胞在一起培养，加入病毒，在4℃条件下病毒附着在细胞

膜上。并使两细胞相互凝聚；

②在37℃中，病毒与细胞膜发生反应，细胞膜受到破环，此时需

要Ca2+和Mg2+，最适PH为8.0一8.2；

③细胞膜连接部穿通，周边连接部修复，此时需Ca2+和ATP；

④融合成巨大细胞，仍需ATP。

聚乙二醇（PEG）法

聚乙二醇（PEG）结构为：HOH2C（CH20CH2)nCH2OH，分子量大于200小于6000者均可用作细胞融合剂。PEG经高压灭菌后，与温热的Engle氏液混合。一般选用分子量为4,000，常用浓度为50%，pH8.0～pH8.2（用10%NaHCO3调整），分子量小的PEG，融合效应差，又有毒性，分子量过大，则粘性太大，不易操作。

电融合法

在直流电脉冲的诱导下，细胞膜表面的氧化还原电位发生改变，使异种细胞粘合并发生质膜瞬间破裂，进而质膜开始连接，直到闭和成完整的膜，形成融合体。

优点：融合率高、重复性强、对细胞伤害小；

装置精巧、方法简单、可在显微镜下观察或录像观察融合过程；

免去PEG诱导后的洗涤过程、诱导过程可控性强。

离心振动

物理方法之一，使用离心机等机器实现细胞之间的融合。

诱导物

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细胞融合的诱导物种类很多．常用的主要有生物法用灭活的仙台病毒(Sendai virus），化学法如用聚乙二醇(Polyethyleneglycol，PEG）和物理法如电脉冲，振动、离心、电激。目前应用最广泛的是聚乙二醇，因为它易得、简便，且融合效果稳定。PEG的促融机制尚不完全清楚，它可能引起细胞膜中磷脂的酰键及极性基团发生结构重排。动植物细胞融合方法不同，生物法利用灭活仙台病毒是动物细胞融合所特有的。

自发条件下或人工诱导下，两个不同基因型的细胞或原生质体融合形成一个杂种细胞。基本过程包括细胞融合导致异核体(heterokaryon）的形成，异核体通过细胞有丝分裂导致核的融合，形成单核的杂种细胞。有性生殖时发生正常的细胞融合，即由两个配子融合成一个合子。

实验操作

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（以人鼠细胞杂交为例）

人鼠细胞杂交

人、鼠细胞融合实验分三步进行∶首先用荧光染料标记抗体∶将小鼠的抗体与发绿色荧光的荧光素（fluorescin）结合，人的抗体与发红色荧光的罗丹明（rhodamine）结合；第二步是将小鼠细胞和人细胞在灭活的仙台病毒的诱导下进行融合；最后一步将标记的抗体加入到融合的人、鼠细胞中，让这些标记抗体同融合细胞膜上相应的抗原结合。开始，融合的细胞一半是红色，一半是绿色。在37℃下40分钟后，两种颜色的荧光在融合的杂种细胞表面呈均匀分布，这说明抗原蛋白在膜平面内经扩散运动而重新分布。这种过程不需要ATP。如果将对照实验的融合细胞置于低温（1℃）下培育，则抗原蛋白基本停止运动。这一实验结果令人信服地证明了膜整合蛋白的侧向扩散运动。

应用价值

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细胞融合

细胞融合不仅可用于基础研究，而且还有重要的应用价值，在植物育种方面已经成功的有萝卜+甘蓝、粉蓝烟草+郎氏烟草、番茄+马铃薯等等。细胞融合另一个重要应用就是制备单克隆抗体。单克隆抗体可以用作诊断试剂，治疗疾病和运载药物，具有准确，高效，简易，快速等优点。

成功例证

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生物种类	细胞来源
甘蓝—青菜	叶—根
大豆—马唐草	愈伤组织—叶
矮牵牛—龙面花	叶—花瓣
大麦—花生	种子—种子
大麦—大豆	叶—悬浮细胞
小麦—矮牵牛	叶—花瓣
油菜—大豆	叶—悬浮细胞
玉米—大豆	叶—悬浮细胞
大豆—野豌豆	悬浮细胞—悬浮细胞
大麦—蚕豆	叶—根
大豆—香草木犀	悬浮细胞—叶
酵母菌—鸡	原生质体—血红细胞
大豆—烟草	悬浮细胞—叶
大豆—秋水仙	悬浮细胞—叶
人—胡萝卜	腹水癌细胞—原生质体
番茄—马铃薯	叶—根尖
人—小鼠	纤维瘤细胞—畸态瘤细胞