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刺突 编辑
在包膜(envelope)表面有病毒膜蛋白质规则地排列着,似如形成某种形态学的单位,称此为刺突。但是也还没有象壳微粒(capsomere)那样的作为已经搞清楚了的构造物赋以应有的定义,实际上可明确显示刺突的电子显微镜照片也并不多。
刺突有些病毒粒子表面,尤其是在有囊膜的病毒粒子表面 具有突起物,称刺突,也称囊膜突起。囊膜对衣壳有保护作用,并与病毒吸附宿主细胞有关。 有些病毒囊膜表面具有呈放射排列的突起,称为纤突(又称囊膜粒或刺突),放射状排列的糖蛋白刺突(囊膜突起)。这些刺突有的是病毒的凝血素(能凝集红细胞),用于起动病毒感染过程,具有诱生免疫保护作用以及中和抗体的能力。有的具有神经氨酸酶的活力,可促使病毒从宿主细胞上释放。
(1)2012年以来中东呼吸综合症病毒流行以来刺突蛋白氨基酸序列呈现出一定的地域性特点,其中来自法国的人源刺突蛋白序列之间的同源性为99.70%~100%,来自阿拉伯联合酋长国的刺突蛋白序列之间的同源性为99.63%~100%,来自2014年阿拉伯联合酋长国的刺突蛋白序列在同一进化树分枝上。
(2)来自沙特阿拉伯的人源刺突蛋白序列未表现出时间上的差异,2013、2014和2015年分离株刺突蛋白的同源性为99.63%~100%,但是来自沙特阿拉伯的刺突蛋白与来自法国和阿拉伯联合酋长国的刺突蛋白区别明显;在进化树上,来自沙特阿拉伯的呼吸综合症病毒刺突蛋白氨基酸序列并没有完全聚在相同的进化分枝上,而是分散在相对集中的不同分枝上。
(3)2014年3、5、6月来自美国的3条刺突蛋白序列之间的同源性为99.70%~99.85%低于和来自沙特阿拉伯的人源刺突蛋白之间的同源性(99.70%~100%)。
(4)不同宿主间来源株的刺突蛋白序列之间无明显区别,其中单峰驼来源的刺突蛋白序列间的同源性为98.15%~100%,其与人源刺突蛋白序列之间的同源性为99.56%~100%,单峰驼源的刺突蛋白序列在进化树上分散在沙特阿拉伯人源刺突蛋白分枝上。
(5)英格兰分离株刺突蛋白之间的同源性为99.70%~99.933%,低于和分离较晚的几条源于沙特阿拉伯的人源刺突蛋白之间的同源性(100%),而与分离较早的来自沙特阿拉伯的刺突蛋白氨基酸序列的同源性较低 (99.78%~99.93%),且分散在不同的分枝上。
(6)来源于韩国分离株的一刺突蛋白与其他刺突蛋白之间的同源性最高为99.78%,处于单独分支上。
(7)来自中国分离株的刺突蛋白序列与来自英格兰以及沙特阿拉伯部分人源刺突蛋白序列同源性为100%。
地区间中东呼吸综合症病毒刺突蛋白的同源性很高,达98.15%~100%,说明刺突蛋白氨基酸序列非常保守。流行的中东呼吸综合症冠状病毒在同一地域内有多种不同的病毒株流行,多地可能同时存在中东呼吸综合症流行,也同时存在地区间输入性快速传播;同一地区不同年份病毒的刺突蛋白变异不明显,不同宿主间的病毒刺突蛋白序列无显著差别 。
严重急性呼吸系统综合征(severe acute respiratorysyndrome, SARS),又称传染性非典型性肺炎(atypicalpneumonia, 简称“非典” ),是2002年11月爆发流行的一种新的传染病,该病传染性强,潜伏期短,进展快,死亡率高,是由严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS coronavirus, SARS-CoV)引起的呼吸系统疾病。自从SARS大规模爆发之后,关于这种新型人类冠状病毒的各项研究,如病原学、流行病学、病毒基因组结构、病毒蛋白的重组表达、临床检测、疫苗的研制、公共卫生管理学等等,也随之快速开展了起来,并取得了很大的进展。
S蛋白
SARS-CoV的刺突蛋白(spike, S)是Ⅰ型跨膜糖蛋白,也是病毒最大的结构蛋白,由1255个氨基酸残基组成,包含了病毒的主要抗原决定簇,能够刺激机体产生中和抗体和介导免疫反应,由球状的受体结合亚基S1和棒状的融合亚基S2两部分组成。近N端的S1和近C端的S2是两个独特的功能结构域,决定了冠状病毒的组织嗜性(受体特异性)和膜融合特性(使病毒进入细胞) 。
研究发现,SARS-CoV的S蛋白可以单独完成包膜病毒颗粒的细胞侵入的全过程,其中包括:(1)识别并结合靶细胞受体;(2)病毒与靶细胞融合,将遗传物质释放到胞内。因为S蛋白是病毒识别宿主细胞表面受体――血管紧缩素转化酶2(Angiotensin-convERTing enzyme 2, ACE2)的关键分子,表达S蛋白的细胞可以与表达ACE2的细胞结合并诱导细胞融合。可见S蛋白在病毒入侵机体时的作用是关键的。另外,S蛋白暴露于病毒表面,含有大量的抗原决定簇, 可以产生针对病毒的保护性抗体。据检测表明,SARS康复病人的血清中普遍存在着抗刺突蛋白的抗体,同时SARS-CoV的S蛋白也能够有效地诱导中和抗体的产生。因此S蛋白是进行疫苗和抗体研究的一个比较理想和有效的靶点。
S1蛋白研究
研究表明, 位于刺突蛋白N端的S1段(17~672 aa)是同受体结合的关键部位,也是中和抗体作用的主要作用靶点,考虑到整个Spike蛋白的分子量较大,结构复杂,进行重组表达较为不便,选择其关键的S1段进行研究是一种可行的方法 。邵红伟 等选取刺突蛋白的S1段进行抗原表位分析,对其中259~565 aa的区段进行了原核重组表达,并对表达产物进行了纯化、复性和抗原性检测。结果发现S1蛋白同阳性对照(灭活病毒) 一样能够被SARS抗血清所特异性地识别,而正常人的阴性血清则没有显示出反应信号,表明重组表达的S1蛋白具有很强的抗原性。 S1蛋白259~565 aa段是诱导机体免疫反应的重要区域,同时还是病毒识别受体的关键区域,他们认为可针对这一区域设计重组疫苗或者制备治疗性抗体。李燕等 通过生物信息学分析,在原核表达系统中表达了SARS病毒S1蛋白。利用SARS流行前正常人血清和SARS患者恢复期的血清,对纯化的重组S1蛋白进行血清学分析。结果发现克隆表达的重组蛋白序列与公布的SARS病毒S1蛋白的序列相同。这表明:获得的重组S1蛋白具有与天然SARS病毒S1蛋白相同的序列,并具有与之相似的血清学反应性,为研究SARS病毒感染免疫应答的过程及其机制和制备SARS病毒的重组疫苗提供了良好的物质基础。
S2蛋白研究
有研究发现,S2蛋白虽然不是病毒识别受体的必要结构,但针对S2的抗体也能阻断SARS病毒感染宿主,而且通过对多个国家和地区的SARS冠状病毒分离株S蛋白的编码基因及氨基酸序列进行同源性分析,发现SARS冠状病毒S蛋白比较保守,变异率低,其中S2比S1更保守,鉴于S2蛋白的保守及其结构特点,S2区现已成为研制保护性疫苗的重要靶位。黄红平等用利用基因重组的方法,将S2基因2170~3162 bp段重组到原核和真核表达载体中,构建S2基因相应的表达载体, 在原核系统中诱导表达重组SARS-CoV-S2蛋白,并使用金颗粒包裹DNA疫苗后用基因枪免疫小鼠。结果发现小鼠产生了针对诱导表达的重组SARS-CoV-S2蛋白的特异性抗体。
冠状病毒S蛋白的S2结构域在病毒和细胞的融合中起重要作用。秦莉等在大肠杆菌中表达GST-S2融合蛋白, 并通过亲和层析纯化GST-S2融合蛋白,用它免疫N1H纯系小鼠获得抗S2的多克隆抗体。
研究发现,动物源性的SARS相似病毒S蛋白与人源性SARS病毒S蛋白有高度同源性,为SARS病毒的动物起源和人畜共患的可能性提供了新的依据。S1和S2是两个独特的功能结构域,它们虽然在感染过程中的作用不相同,但是在SARS康复病人血清中,它们的特异性抗体滴度都增高,研究者也可以通过试验获得多克隆抗体,Huang等通过研究也认为S蛋白有利于研发非典疫苗。多数研究学者针对S2蛋白的保守及其结构特点认为S2区是研制保护性疫苗的重要靶位。S蛋白的研究对非典疫苗的研究、生产和预防及对SARS的治疗非常有价值,对将来面对突发事件提供了有利的引导, 对医学事业的发展也有重要意义 。