中文名：实罐灭菌

外文名：Realtanksterilization

别名：间歇灭菌或分批灭菌

特点：无需灭菌设备，灭菌效果可靠

灭菌所用蒸汽：0.2~0.3MPa

缺点：对培养基成份破坏较大

在进行培养基灭菌之前，通常先把发酵罐空气分过滤器灭菌并用空气吹干。进料后，开动搅拌以防止沉淀。然后开启夹套蒸汽阀，缓慢引进蒸汽，使料液升温至80℃左右后关闭夹套蒸汽阀门。开三路（空气、出料、取样）进汽阀，开排汽阀。当温度升到110℃时，控制进出汽阀门直至121℃（表压0.1~0.15MPa） ，开始保温，一般保温20min。保温结束后，关闭过滤器排汽阀、进汽阀。关闭夹套下水道阀，开启冷却水进回水阀。待罐压低于过滤器压力时，开启空气进气阀引入无菌空气。随后引入冷却水，将培养基温度降至培养温度 。

实罐灭菌时一般应掌握如下几点：

（1）蒸汽进入夹层或蛇形管预热时，应同时打开排气口，充分排出罐内空气。

（2）灭菌过程进入罐内蒸气量要大，尽可能采用三路蒸气直接进内层。

首先确认蒸汽发生器的各开关都处于正常状态，向发酵罐内加入水，将蒸汽发生器打开，然后检查发酵罐的各个开关是否都处于关闭状态。清洗罐内，用自来水冲洗，并且取下pH电极，pH电极使用前要进行校正，校正用两种标准溶液，一种pH为4，另一种pH为6.86，校正方法与一般电极相同，校正完成后插上电极。确认排料口已经关闭，向罐内注入6L的LB培养基，培养基的配方与种子培养时的培养基配方相同，然后旋紧加料口盖，打开搅拌，搅拌速度为200rpm。打开蒸汽发生器的蒸汽输出阀门，打开发酵罐的蒸汽通路总阀和排料口的蒸汽阀，排尽管路中残存的冷凝水，等出料口只有水蒸汽冒出时，就说明冷凝水排尽，此时关闭排料口的蒸汽阀门，打开通入夹套中的蒸汽阀门，与排污阀，控制夹套中的压力，使其处于1.5MPa到2.0MPa左右，罐内的温度会迅速上升，等温度达到95℃时就可以关闭搅拌了，此时罐内的培养基已经沸腾无需搅拌，混合的效果已经很好，同时要开始控制罐顶端的排气阀，先全开，以排尽罐内的空气，然后适当关小此阀，使罐内的压力略大于大气压。当温度达到121℃时，实罐灭菌开始计时，同时控制罐压和夹套内的压力，温度才能维持在121℃。

计时开始十分钟后，打开空气过滤器的蒸汽阀门和隔膜阀，对空气通路灭菌。在维持121℃结束前，校正溶氧电极，设置为亚硫酸钠，即溶氧为设定为0。计时结束后关闭所有的蒸汽阀门，向夹套中通入自来水，此时排污阀仍需要适当打开，因为罐内培养基会使冷却水气化，此时要吹干空气过滤器内的滤棉，当罐内的温度降到95℃时，打开搅拌，转速设定在200rpm，关闭排污阀和排气阀，向罐内通入无菌空气，当罐压上升后，打开排气阀。当罐内的温度下降到40℃时，启动控温程序，关闭一个水阀，使水流经控制器后在进入夹套。此时可以校正溶氧电极，设置为空气，即溶氧设定为100 。

1、设备成本低；

2、染菌风险低，连续灭菌过程需要将灭菌发酵液无菌输送至无菌发酵罐；

3、易于人工控制；

4、易于处理含有高比例固体物质的培养基。

5、灭菌用蒸汽要求低（0.2~0.3MPa）。

1、灭菌温度低、时间长而对于培养基的营养成份破坏大；

2、蒸气用量波动大。

3、工业生产中难以实现自动控制。